植物组织培养的发展与展望

摘要:植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的原理而发展起来的一门生物技术。本文简要概述了植物组织培养的概念及研究进展，较全面的综述了植物组织培养新技术以及在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面的研究现状，最后展望了植物组织培养的发展趋势。关键词：组织培养；研究进展；发展趋势

引言

植物组织培养是20世纪之初，以植物细胞全能性为理论基础发展起来的一门新兴技术，是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工配制的环境里培养成完整的植株，也称离体培养或植物克隆。自年德国科学家Haberlandt提出植物细胞具有全能性理论,到年美国White等用番茄根进行离体培养证实这一观点以来,植物离体培养技术在基础理论和应用研究，已广泛应用到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等各个研究领域,成为生物学科中的重要研究技术和手段之一[1]。近年来，随着科学技术的不断发展，植物组织培养新方法和新技术不断涌现，研究重点也由器官、细胞水平向分子、基因方向转移。21世纪，生物技术是最有生命力的一门学科，而植物组织培养作为一种基本的试验技术和基础的研究手段，被认为具有巨大的潜力，现就植物组织培养技术研究进展做一简单综述。

1在植物育种上的应用

植物组织培养技术对培养有粮作物品种开辟了全新的途径。目前，国内外已在植物组织培养普遍应用于作物育种[2]，并在单倍体育种，胚胎育种，细胞融合育种，细胞突变育种，基因工程育种等方面取得了较大的进展。

1.1单倍体培养育种

单倍体育种（haploidbreeding）是植物育种手段之一。即利用植物组织培养技术（如花药离体培养等）诱导产生单倍体植株，再通过某种手段使染色体组加倍（如用秋水仙素处理），从而使植物恢复正常染色体数[3]。单倍体是具有体细胞染色体数为本物种配子染色体数的生物个体,在国际上引起了很大的重视,各国纷纷开展单倍体育种方面的研究工作自年Guha等获得世界上第一株曼陀罗的花药单倍体植株以来,已有农作物如水稻、小麦、玉米高粱等;经济作物如大豆、橡胶、烟草、油菜等;园艺作物如苹果、葡萄、辣椒、黄瓜、油菜以及许多药用植物如枸杞、人参、地黄、平贝母等获得单倍体植株,目前已有多种植物花药培养获得成功。年,我国科学家利用单倍体培育出世界上第一个作物新品种烟草单育1号,随后又育成水稻中华8号、小麦京华1号等作物新品种。现在已经培育出水稻新品种15个、小麦新品种6个。在林业育种方面我国学者在单倍体培养方面也做了大量研究,已有20~30种树木获得了花粉植株,并初选出了一些优良的杨树,橡胶等花粉植株品系。我国在花药培养及单倍体育种方面总体上处于世界前列,由朱至清等研制的N6培养基广泛应用于禾本科植物的花药和花粉培养,已成为国内外花培的通用培养基。

1.2胚胎培养育种

植物的胚(包括成熟胚和幼胚)、胚珠、子房和胚乳的离体培养技术统称胚胎培养,其应用领域主要包括胚胎发育机理、克服杂交不亲合、胚胎拯救、克服自交不亲和、克服珠心胚的干扰、打破种子休眠、获得体细胞胚和人工种子等方面,因此在农作物、园艺作物、林木和药用植物上有着广泛应用。在克服杂交不亲合、克服自交不亲和方面主要通过植物离体受精来实现,在广义上通过离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉、离体精细胞和卵细胞融合等均称做植物离体受精(invitroFertilization,IVF)。但严格意义上的离体受精或试管受精是20世纪90年代精、卵离体融合成功。该技术不仅可以克服植物授粉不亲和问题,还可以进行胚胎、种子和果实发育机理等基础研究。人工分离的精细胞和卵细胞融合后进行合子胚培养,已在玉米、药用牡丹、罂粟、烟草等植物上获得成功。植物离体受精技术是植物细胞工程中的重要实验技术,为研究植物胚胎发育机理提供了新的实验系统,为开发新的植物转基因途径提供了可能。胚培养在打破种子休眠应用较为广泛,种子休眠的原因很多,利用组织培养方式打破种子休眠一般有种胚发育不全或种子含抑制物抑制种胚发芽2种情况,如胚乳发育尚不完全的兰科种子可以通过组织培养的方式获得再生植株,而鸢尾属、蔷薇科、野麦等植物可以通过组织培养的方式打破抑制物对种子发芽的影响。另外,胚培养还可以应用于胚胎拯救。胚乳培养的主要目的是获得具有利用价值的三倍体植株,再经过染色体加倍获得六倍体,从而育出多倍体新品种。目前有40多种植物的胚乳培养达到了不同程度的细胞分化或器官分化,不少植物已获得了再生植株。我国在马铃薯、小麦、水稻、苹果、桃、猕猴桃等10多种植物上得到了胚乳再生植株。同时,胚乳培养产生的混倍体,可用于染色体工程方面的研究。

1.3植物细胞融合

细胞融合所使用的材料一般是指利用除去植物细胞壁的裸露细胞即原生质体,通过原生质体融合,可克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍,为广泛重组遗传物质开辟了新途径。同时,因去壁后的原生质体消除了核酶等对外源DNA的破坏,为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件。另外,在有些没有有性生殖能力或其有性生殖能力很低(如香蕉、木薯、马铃薯、甘蔗等)的植物作物改良中,体细胞杂交具有不可取代的重要性。从年Cocking采用酶解法分离原生质体获得成功后,科学家们在细胞融合方面做了大量的研究工作,年,Carlson采用聚乙二醇的方法促使两种原生质体融合,培育出第一株烟草体细胞种间杂种,使细胞融合技术产生了一个崭新的飞跃。在我国,年开始原生质体培养和体细胞杂交的研究,迄今为止,我国科学家首先获得原认为叶肉组织分离的原生质体较好,遗传性较为一致。在原生质体融合方面主要有物理(如电融合)、化学(如高PH高钙、聚乙二醇)、生物(如仙台病毒)等融合方式。

1.4细胞突变体育种

在研究中发现,通过愈伤组织获得的再生植株中常常出现基因型变异。这是因为无论是愈伤组织还是细胞培养,培养细胞均处在不断分生状态,容易受培养条件和外界环境(如物理因素、化学物质等)的影响而产生诱变。起初人们认为这种变异是有害的,直到年Heinz在甘蔗的再生植株中观察到许多有益的突变体,特别是抗病性方面有明显提高,此后人们才逐步认识到变异体在品种改良上有利用价值。朱至清等研究认为应用在细胞水平上进行突变体选择的技术,可以在一定程度上使高等植物的育种程序微生物化,从而大大提高选择效率,节省时间和土地面积,并且不受季节的限制。利用这一特点结合人工诱变方法包括物理诱变(射线、X射线、电子束、离子束、激光、紫外线等)、化学诱变(甲基磺酸乙酯、秋水仙素、叠氮化钠、平阳霉素、52BU、EB等)和生物诱变(转座子插入突变、跳跃基因等)获得了一大批植物新品种和新材料。目前,这种方法已筛选出抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的植物突变体。

1.5基因工程育种

通过基因枪或农杆菌进行植物基因工程育种的关键环节之一是建立一个高效的组织培养再生体系。植物遗传转化的理想受体系统应具有高效稳定的再生能力,研究认为用于基因转化的受体系统,应具有80%~90%的再生频率,且每个外植体必须具有能再生的丛生芽,其芽数量越多越好。目前,用于遗传转化的受体主要有二种途径,一是外植体在激素的诱导下产生愈伤组织后再培养成体细胞胚即体细胞胚发生途径,二是诱导外植体产生单极性不定芽后再培养生成完整的再生植株即器官发生途径。目前,与组培技术结合的转基因的方法主要有农杆菌介导、基因枪2种方法。自从年首次获得转基因植物以来,目前已有35科多种植物转基因获得成功,用于商业化种植作物的主要有大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、西葫芦、木瓜等。

3.1在次生代谢物生产方面的应用

药用植物次生代谢物种类繁多，化学结构迥异。现在已知大约有种次生代谢物，包括酚类、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机物等[4]。组织培养技术应用在药学方面的工作虽然历史不长，但发展很迅速，它具有如下一些优点：利用组织培养代替原植物的栽培以获得所需的有效成份，达到产量高，成本低的目的，还可节约土地。

3.1.1紫杉醇

紫杉醇是用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌的高效、低毒、广普而且作用机理独特的抗癌药物。近年来，临床研究还表明，紫杉醇对其它病症也有一定疗效，如关节炎、先天性多囊肾病、早老性痴呆等。

日本从短叶红豆杉和东北红豆杉中进行组织细胞培养获得较高含量的紫杉醇细胞系植株。我国的研究人员经过多年研究，利用细胞悬浮培养对多种红豆杉不同外植体进行愈伤组织的诱导、培养、筛选出了紫杉醇高产细胞株，并经生物反应器扩大培养含量，细胞生长和紫杉醇含量都相当理想，通过细胞培养技术规模化商业化生产紫杉醇的研究已取得了重大的进展。

3.1.2紫草宁

紫草宁可以用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物。年，Tabata等研究了在哪一种培养基上可使培养细胞产生紫草宁衍生物。年Tabata和Fujita等进行悬浮培养，并得到紫草宁衍生物。日本在年也用大规模紫草细胞培养来生产紫草宁。国内南京大学生物系从年开始研究，得出在适当的培养条件下，培养的紫草细胞悬浮无中紫草宁含量占干重的14%，比紫草根中含量高几倍。

3．1.3薄荷油

目前已经开始采用胡椒薄荷细胞培养技术生产工业薄荷油，但产量很低，这主要是因为菇烯单体的不稳定性及植物毒素的毒性作用而影响到薄荷油的合成。如今，胡椒薄荷中菇烯单体的合成途径已经基本确定。此外，在采用经根癌农杆菌T37转化后的薄荷顶芽培养物，发现薄荷油物质的生物合成与菇烯类物质有关，已测出菇烯类物质是由叶部的油腺所分泌。这些发现必将促进工业薄荷油的生产。

3.1.4花青素

花青素广泛存在于各种植物物种中，主要集中于花，花尊及果实部分，呈现粉红、红、紫及蓝色，用作食品添加剂可获得诱人的自然的红色。随着国际社会对健康的重视，很多合成色素因使用安全问题被禁用，低毒性的天然花青素就有着巨大的应用潜力。在年与年Iiker和Francis建议将植物细胞培养的天然花青素产品制品作为合成花青素的替代产品。有许多厂家和研究机构从事从各种植物细胞中生产天然色素的生产研究，并取得很大的进展。HarigaeYasushi用选择可见高产细胞团的方法，在MS培养基上挑选出繁殖快的高产花青素葡萄细胞系，在30L的小型发酵罐中培养，粗花青素产率达到0.3%；Kobayashi，Yashinori等在光照条件下悬浮培养花青素的土当归细胞，在SOOL发酵罐中培养16d收获细胞，细胞重量增加26倍，花青素产量5倍，占细胞干重的17.2%。随着研究工作的进一步深人，植物细胞培养花青素将进人工业化阶段。目前已有报道的能生产花青素的植物有：大戟属、翠菊属、甜生豆、矢车菊属、玫瑰花、紫菊属、苹果、葡萄、胡罗卜、野生胡罗卜、葡萄藤、土当归、商陆、筋骨草属、靶苔属等。报道过的能用植物细胞培养生产的色素有胡罗卜素、叶黄素、单黄酮体等。

4种质资源的保存和基因库的建立

生命物质的保存，已引起许多科研工作者的兴趣，其中包括原核生物、植物及动物材料的保存，种质保存的目的是为了确保有用的种质能在任何时候都具有生命力。组织培养能安全地保存植物的细胞、愈伤组织或分生组织，且在储藏几年后，仍能稳定地产生再生过程。通过无性系繁殖保存作物已成为迫切要求，尤其对于热带作物。另外，由于自然和人为的破坏，许多具有或可能具有育种价值的能成为基因库的品系在消失，作物栽培品种、亲本植物品系以及突变种也通常需要保存。组织培养对于植物生长和基因型保存研究要比大田繁殖优越，节省土地、人工、能源。组织培养材料体积小，对于冷冻后解冻还能存活的细胞来说，利于在低温或超低温中长期保存。种质资源的保存和基因库的建立在育种工作中是十分重要的。济南亚龙生物科技有限公司已建立几百种植物组培技术储备和部分植物组培苗的种质资源库。

展望

虽然组培育苗存在成本高、技术复杂等问题，但随着科学技术的不断发展，组培育苗将在未来植物繁殖中占有重要地位[6]。其发展趋势如下：

（１）组培技术育苗植物种类不断增加。

如组培技术育苗种类有果树、蔬菜、草坪草、花卉、香料植物、药用植物、茶叶、农作物等，既有草本又有木本。如济南亚龙组培的生姜、大蒜、草莓等组培育苗项目。

（２）组培技术程序简化，组培成本降低。

例如：用全自然光代替人工光照的组培育苗技术，使组培育苗的成本大幅度降低；新药品、新方法的运用将使传统的组培技术得以改进，使组培育苗技术更经济、

更实用。

（３）组培技术不断提高。由最初的茎尖快繁到花药培养、胚胎培养、原生质体培养、体细胞杂交等。

（４）组培技术的应用范围不断扩大。由植物的简单繁育到突变体选育、种植资源保存等。

（５）组培技术逐渐向自动化方向发展。

随着现代化温室在我国的应用及环境控制水平的提高，组培育苗将与现代化温室、电脑自控调节等手段相结合，使其效率更高。

参考文献

[1]李胜,李唯.植物组织培养原理和技术[M].北京：化学工业出版社，.10：1

[2]夏镇澳.植物组织培养与农业[J].植物生理学通讯[J].，31（1）：62-64

[3]张东旭，周增产，卜云龙，等.植物组织培养的应用研究进展，（06）：~

[4]项雷文，郑建兵.植物细胞培养技术生产天然产物[J].《食品研究与开发》，，6(23)：4-6

[5]李永欣,王义强.植物组织培养的应用研究概述[J].江苏林业科技,,32(3):.

[6]李晓蕙，陈蕾.植物细胞培养技术的发展与应用[J].安徽农学通报.AnhuiAgri.Sci.Bull，，12(5)

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